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松疱锈病菌检疫技术操作办法

作者: 来源: 时间:2017年03月13日

松疱锈病菌检疫技术操作办法

主题内容及应检范围

1.1  本办法规定了松疱锈病菌Cronartium ribicola J. C. Fischer ex Rabenhorst 的检疫检验及检疫处理操作办法。

1.2  本办法适用于林业植物检疫机构对松属Pinus spp.中单维松植物活体、带皮原木以及转主寄主中茶藨子属Ribes spp.、马先蒿属Pedicularis spp.的植物活体或带菌材料的检疫检验和检疫处理。

产地检疫

2.1  种苗繁育基地的建立

2.1.1  种苗繁育基地及其周围500 m以内,必须铲除茶藨子和马先蒿等转主寄主植物。

2.1.2  种植培育的五针松苗木应定期调查,发现可疑苗木应立即拔除集中烧毁。

2.2  踏查

2.2.1  在种苗繁育基地、天然林、人工林、种子园、母树林、贮木场及加工场(点)、集贸市场,以林班线、小班线、林间道路或木材堆垛为单位,或选择有代表性的林分(或堆垛)进行线路踏查。

2.2.2  春季(4 ~ 5月)调查松树皮层是否增厚变软、产生裂缝,从中生出橘黄色疱囊,破裂后释放出黄色锈孢子粉并伴有流胶;5 ~ 7月调查林间转主寄主植物(茶藨子或马先蒿等)叶片背后是否有具被膜的黄色丘疹状夏孢子堆;7 ~ 9月是否有红褐色毛刺状的冬孢子柱;秋季(9 ~ 10月)调查针叶是否有黄色至红褐色斑点,枝干皮层是否产生橘黄色“蜜滴”(即有甜味的性孢子液)及皮下“血迹斑”(性孢子液风干后的痕迹)。

2.2.3  在储木场或加工场所、集贸市场调查新鲜带皮原木皮层是否有黄色锈孢子粉。

2.2.4  经踏查确认有疫情,需进一步掌握危害情况的,应设标准地(或样方)做详细调查。

2.3  标准地(或样方)调查

2.3.1  种苗繁育基地设置与调查

2.3.1.1  样方的累积面积应不少于调查总面积的5%

2.3.1.2  每块样方面积为1 ~ 5 m2 1 ~ 2 m长的条播带。用五点取样法或对角线取样法,抽取样树不得少于30株。

2.3.2  林分标准地设置与调查

2.3.2.1  片林按林分面积设置,5 hm2 以下(含5 hm2)设1块;5 hm2 以上按发生总面积的2%设置。

2.3.2.2 每块标准地面积为0.1 hm2,采取对角线取样法抽取样树25株,进行病害分级调查。

2.3.3  贮木场及加工场(点)、集贸市场样方的设置与调查

2.3.3.1  带皮原木应采取楞垛表层或分层方式设点调查。

2.3.3.2  调查数量为每批次(堆、垛)不得少于3 ~ 6根样木,每根样木选设10 cm × 20 cm 样方数4 ~ 6个。

2.4  病害分级标准

单株病害分级标准

I级  全株健康无病                                           代表值0

Ⅱ级  侧枝发病,有蜜滴或疱囊                                 代表值1

Ⅲ级  干部发病,有蜜滴或疱囊,病斑占树干周长1/2以下         代表值2

Ⅳ级  干部发病,有蜜滴或疱囊,病斑占树干周长1/2以上         代表值3

Ⅴ级  全株死亡                                               代表值4

林分病害分级标准(以被害株率为标准)

  发病株率 5%以下;  

  发病株率 6% ~ 10%

  发病株率 11%以上。

调运检疫

3.1  抽样比例

3.1.1  苗木按一批货物总件数(株)的5%抽取,少于10件或100株的应全部检查。

3.1.2  带皮木材、原木少于5 m3的全部检查;5 m3以上的抽样数量不得少于总数的10%

3.2  抽样方法

3.2.1  苗木按抽样比例,采取分层方式,随机设5个样点进行抽样。

3.2.2  带皮木材、原木按抽样比例,采用楞垛表层或分层方式逐根进行检查。

3.3  现场检验

3.3.1  3 ~ 5月,用肉眼或借助放大镜检查松树植株活体干枝皮部表面是否有锈孢子器或锈孢子粉,8 ~ 10月检查树皮下部是否有性孢子器(或血迹状斑痕)。

3.3.2  6 ~ 8月检查茶藨子或马先蒿等转主寄主叶片背面是否有橘黄色夏孢子堆或红褐色的冬孢子柱。

检疫检验

4.1  症状检验

4.1.1  松树寄主症状检验

4.1.1.1  4 ~ 7月间检查发病植株的枝干部是否有流脂、皮层肿大、破裂并从裂缝中生出黄白色至橘黄色的锈孢子器(疱囊)或散发出大量锈黄色的锈孢子。

4.1.1.2  8月下旬至9月中旬,感病枝、干皮层可见初期呈白色后变橘黄色泪滴状“蜜滴”(即性孢子液),“蜜滴”消失后皮下可见“血迹”状斑。

4.1.2  转主寄主症状检验

5 ~ 9月(南方5 ~ 8月,北方7 ~ 9月)调查茶藨子属、马先蒿属等转主寄主植物叶片背面有无带油脂光泽、具包膜的橘红色丘疹状夏孢子堆,在夏孢子堆中或其周围组织是否有红褐色毛刺状的冬孢子柱。

4.2  形态鉴定

4.2.1  性孢子(ο)  无色,鸭梨形,单胞,大小为(2.4 ~ 4.5mm×(1.8 ~ 2.5mm;性孢子器黄白色或橘黄色,基部(皮层下)宽8 mm以下,平展于松树皮层中。

4.2.2  锈孢子(Ⅰ)  单个孢子锈黄色,成堆时橘黄色,球形或卵圆形,大小为(22.8 ~ 33.6

mm×(14.4 ~ 28.8mm,表生柱状疣突;并有一与疣突顶部共处一球面的平滑区;锈孢

子器由无色梭形细胞组成疱囊状或圆柱状包膜所包裹,初为黄白色,后为橘黄色,生于

枝干皮层外,高4 ~ 6 mm,短径3 ~ 5 mm,长径4 ~ 40 mm

4.2.3  夏孢子(Ⅱ)  鲜黄色,球形、卵形或椭圆形,表面有刺,大小为(15.6 ~ 30mm ×(13.1 ~ 20.6mm;夏孢子堆丘疹状突起,橘红色,具油脂光泽,破裂后呈橘红或红褐色的粉堆。

4.2.4  冬孢子(Ⅲ) 褐色,长棱形,表面光滑,大小为(36 ~ 59mm ×(13.0 ~ 13.5mm;冬孢子柱初为黄褐色,后呈红褐色,呈毛状,直立或弯曲,直径87 ~ 165 mm,长50 ~ 1900 mm,多从夏孢子堆中生出,少数从夏孢子堆外的新叶组织中生出。

4.2.5  担孢子(Ⅳ)  单胞,透明无色,球形,具油球,顶端有一喙状小尖突;大小为10 ~ 12 mm

4.3   显微化学检验

4.3.1  检测对象 3 年生以下实生苗或非发病季节的可疑罹病松针、枝干部皮层。

4.3.2  选取1 ~ 3 年生幼苗上带有黄色或红褐色斑点的松针1 cm段或罹病松针之小(侧)枝5 cm×5 cm×1 cm大小皮层作样品;对成龄植株枝干上有黑色粗皮者,于病健组织交界处切取2 cm ×4 cm 大小的树皮2 ~ 3块作为受检样品。

4.3.3  将采集的可疑性针叶组织样品和枝干皮层组织样品,用FAA固定液脱脂处理2­ ~ 24 h后供切片用。FAA固定液配方:福尔马林5 ml + 冰醋酸6 ml + 50%(适合柔软组织材料)+70%酒精(适合坚硬组织材料)89 ml,充分混合即成。

4.3.4  检验药品及工具

4.3.4.1  药品:醇溶性苯胺蓝、无水乙醇、番红花红、乳酸、苯酚、甘油、硫酸、亮绿、孔雀石绿、福尔马林、蒸馏水等。

4.3.4.2  工具:生物显微镜、分析天平、试剂瓶、刀片、吸管、染色板、镊子、洗瓶、量筒、量杯、载玻片、盖玻片等。

4.3.5   试剂配制

0.25 %苯胺蓝液:醇溶性苯胺蓝0.25 g + 95 %乙醇100 ml,充分摇匀;

0.05 %番红乙醇液:番红花红T 0.05 g + 50 %乙醇100 ml,充分摇匀;

乳酚蓝液:乳酸20 ml + 苯酚20 g + 甘油40 ml + 蒸馏水20 ml + 0.25 %苯胺蓝液0.3 ml,充分摇匀;

0.1 %亮绿液:亮绿SF 0.1 g + 无水乙醇100 ml,充分摇匀;

0.3 %番红福尔马林液:番红花红T 0.3 g + 福尔马林100 ml,充分摇匀;

5 %孔雀绿液:孔雀石绿5 g + 蒸馏水100 ml,充分摇匀;

0.5 %番红液:番红花红T 0.5 g + 蒸馏水100 ml,充分摇匀;

浮载剂:5%硫酸液。

4.3.6  染色检验方法及结果 

根据试验条件,可选择下列任一种染色方法即可。

4.3.6.1  苯胺蓝-番红染色法  待检组织切片置于载玻片上 + 0.25%苯胺蓝液(媒染剂)染色5 min→蒸馏水冲洗→0.05%番红乙醇液浸染1 ~ 3 min →蒸馏水漂洗干净→镜检。如被侵染,则菌丝呈蓝色至蓝绿色,寄主组织呈黄色至棕黄色。

4.3.6.2  乳酚蓝染色法  待检组织切片置于载玻片上+乳酚蓝液浸染5 ~ 10 min→蒸馏水漂

洗干净+5%硫酸(作浮载剂)→镜检。如被侵染,则菌丝呈蓝色,寄主组织呈木黄色或本色。

4.3.6.3  亮绿-番红染色法  待检组织切片置于载玻片上+0.1%亮绿液浸染3 ~ 5 min →蒸馏水清洗→0.3%番红福尔马林液染1 ~ 5 min →蒸馏水漂洗干净→镜检。如被侵染,则菌丝呈绿色,寄主组织呈棕红(黄)色。

4.3.6.4  孔雀石绿-番红染色法  待检组织切片置于载玻片上+5%孔雀绿液浸染2min→蒸馏水清洗→0.5%番红液染3 ~ 5 min→蒸馏水漂洗→5%硫酸(作浮载剂)→镜检。如被侵染,则菌丝呈绿色,寄主组织呈棕红(黄)色。

4.3.7  根据上述染色检验结果和柱锈属Cronartium分种检索表(附录),在待检皮层细胞内发现菌丝时,可确认样品被松疱锈病菌侵染。如仅在松针细胞内发现菌丝,则不能区分样品是被松针锈病菌Coleosporium sp.还是松疱锈病菌侵染,需进一步通过试种观察确定:如针叶组织中的菌丝不向枝干皮层蔓延,则非松疱锈病菌,反之,即为松疱锈病菌。

5 除害处理

5.1 调运检疫和复检中,发现带有锈孢子器或性子器的带皮松原木,必须去皮并将病皮销毁。

5.2 发现茶藨子或马先蒿等转主寄主植物叶背有夏孢子堆或冬孢子柱时,应予销毁。


附录 

柱锈属Cronartium分种检索表

1.  单维松寄生……………………………………………………………………………………2

双维松寄生……………………………………………………………………………………4

2.        五针松寄生;锈孢子器基部 (皮层下) 8 mm以下………………………………………3

单叶松和食用松寄生;锈孢子基部宽10 mm以上………………西方柱锈菌C. occidentale

3.        转主寄主以茶藨子为主………………藨子柱锈菌茶藨子专化型C. ribicola f. sp. ribicola

转主寄主以马先蒿为主………… 藨子柱锈菌马先蒿专化型 C. ribicola f. sp. pedicularis

4.  生枝干上………………………………………………………………………………………5

生球果上 ……………………………………………………………………………………11

5.        病部皮层坏死形成溃疡  ……………………………………………………………………6

病部皮层不坏死,木质部增生形成木质瘿瘤…………………………………………… 10

6.        锈孢子表面无光滑区 ……………………………………………………………………… 7

锈孢子表面有光滑区…………………………………………………………………………8

7.  锈孢子梨形至棒形……………………………………………… 云兰柱锈菌C. comandrae

锈孢子长椭圆形 …………………………………… 阿巴拉契亚柱锈菌C. appalachianum

8.  病部木质部增生形成纵向隆起带……………………………… 香蕨柱锈菌C. comptoniae

病部皮层增生略肥大呈长梭形 …………………………………………………………… 9

9.        锈孢子表面有明显的光滑区;分布北美洲………………类鞘孢柱锈菌C. coleosporioides

锈孢子表面有近似的光滑区;分布欧洲和亚洲 ……………… 柔软柱锈菌C. flaccidum

10.  瘿瘤球形,半球形……………………………………………………栎柱锈菌C. quercuum

瘿瘤梭形………………………………栎柱锈菌梭型专化型C. quercuum f. sp. fusiforme

11.  锈孢子器半埋于寄主组织中;分布美国东南部………………球果柱锈菌C. strobilianum

锈孢子器完全突出寄主表面;也可危害小枝形成髓质瘤;分布美国南部至中美 洲……………………………………………………………… 椎型柱锈菌C. conigenum